utrwalanie preparatow, uniwersytet warmińsko-mazurski, inżynieria chemiczna i procesowa, rok III semestr 6, ... [ Pobierz całość w formacie PDF ]
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
–
studia zaoczne
Ćwiczenie 1
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Ć
WICZENIE
1: R
ODZAJE I
Z
ASADY
P
RZYGOTOWYWANIA
P
REPARATÓW
M
IKROBIOLOGICZNYCH
Technika wykonania preparatów mikroskopowych
Małe wymiary komórek mikroorganizmów nie pozwalają na ich obserwację okiem
nieuzbrojonym. Do badania morfologii, oceny liczebności czy żywotności drobnoustrojów
stosuje się obserwacje mikroskopowe preparatów wykonanych bezpośrednio z materiału
badanego (np. preparaty odciskowe) lub z hodowli.
Przygotowane preparaty można oglądać bezpośrednio pod mikroskopem lub dodatkowo je
wybarwić. Celem barwienia jest ułatwienie:
• obserwacji cech morfologicznych i diagnostycznych (m.in. kształt, wielkość, wzajemny
układ komórek w hodowli, tzn. występowanie komórek pojedynczo lub w różnych
układach, obecność otoczek, zdolność ruchu, ilość i rozmieszczenie rzęsek/wici, sposób
rozmnażania się – przez podział, tworzenie pą zków, zarodników i form przetrwalnych),
c
Barwienie drobnoustrojów jest procesem fizykochemicznym, który polega na wniknięciu
barwnika do wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu z cytoplazmą. Do barwienia
mikroorganizmów najczęściej stosuje się zasadowe barwniki (
błękit metylenowy, zieleń
malachitowa, fuksyna zasadowa, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny, goryczkowy
i metylowy
), wykorzystując ich powinowactwo do kwaśnej cytoplazmy komórkowej. Rzadziej
używane są barwniki kwaśne (
fuksyna kwaśna, eozyna, erytrozyna, barwnik Kongo i
nigrozyna
) lub obojętne mieszaniny barwników kwaśnych i zasadowych (np.
barwnik
Giemsy
).
W zależności od sposobu barwienia wyróżniamy barwienia
przyżyciowe
i barwienie
preparatów utrwalonych
.
1 . Przygotowanie preparatów przyżyciowych
Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości, żywotności, sposobu
rozmnażania, a czasami do wykrywania substancji zapasowych. Najczęściej prowadzi się
obserwacje drożdży i pleśni ze względu na ich budowę i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze
względu na małe rozmiary, ogranicza się jedynie do oceny ich ruchliwości.
Preparaty przyżyciowe wykonuje się na szkiełku podstawowym (w kropli spłaszczonej),
a w przypadku badania ruchliwości bakterii lub prowadzenia obserwacji nad sposobem
rozmnażania drożdży preparaty wykonujemy na szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą
Lindnera (w kropli wiszącej).
1.1. Wykonywanie preparatu w kropli spłaszczonej
Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym (wyjęte z alkoholu, dokładnie wytarte
i trzykrotnie przeciągnięte nad płomieniem palnika) umieszcza się kroplę płynnej hodowli
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
1
• liczenia drobnoustrojów (żywych, martwych).
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
–
studia zaoczne
Ćwiczenie 1
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
drobnoustrojów i nakrywa szkiełkiem nakrywkowym, opuszczając je ukośnie w celu
wyeliminowania pęcherzyków powietrza. Nadmiar płynu osusza się bibułą filtracyjną
(rys. 1.). Przy sporządzaniu preparatu z hodowli na podłożu stałym lub z produktów o
konsystencji mazistej należy nanieść na szkiełko najpierw kroplę jałowej wody destylowanej,
a następnie pobrany za pomocą ezy materiał rozprowadzić w tej kropli. Całość nakryć
szkiełkiem nakrywkowym.
Preparaty przyżyciowe należy oglądać bezpośrednio po przygotowaniu, żeby nie dopuścić do
przeschnięcia materiału. Najlepszą jakość uzyskuje się przy preparatach cienkich, blisko
brzegu kropli.
Rys.1. Schemat wykonania preparatu przyżyciowego
1.2. Wykonywanie preparatu w kropli wiszącej (w komorze Lindnera)
Komora Lindnera to szkiełko podstawowe z wgłębieniem. Brzegi wgłębienia komory
Lindnera smaruje się wazeliną (1). Na środku odtłuszczonego szkiełka nakrywkowego
umieszcza się kroplę badanej hodowli (2), szkiełko szybko odwraca się i przykleja do
brzegów wgłębienia w ten sposób, aby kropla wisiała w powietrzu mniej więcej na środku
wgłębienia (3). Lekko docisnąć szkiełko, wazelina uszczelnia i spowalnia wysychanie
preparatu (rys. 2.). Najlepiej oglądać preparat blisko brzegu kropli gdzie jest najcieńszy.
Rys. 2. Preparat w komorze Lindnera
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
2
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
–
studia zaoczne
Ćwiczenie 1
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
1.3. Barwienie preparatów przyżyciowych
Preparat przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc wykonać
barwienie obok kropli z materiałem badanym umieszcza się kroplę barwnika, miesza ezą
i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. Stosowane barwniki nie mogą być toksyczne i muszą
się charakteryzować wysoką kontrastowością. Mimo że używa się ich w bardzo dużym
rozcieńczeniu i tak wywołują zahamowanie rozmnażania.
Przykłady:
• barwienie błękitem metylenowym (rozcieńczenie 1:10 000) pozwala ocenić żywotność
drożdży; barwnik przenika do wnętrza martwej komórki, która barwi się na
ciemnoniebiesko,
• barwienie płynem Lugola umożliwia wykrycie w komórce drożdży substancji
zapasowych – glikogenu, który barwi się na brunatno, a cytoplazma komórki jasnożółto,
• barwienie bakterii płynem Lugola pozwala u gatunków beztlenowych wykryć granulozę -
cukier stanowiący substancję zapasową tych bakterii.
Mechanizm barwienia przyżyciowego może być różny i nie jest on jeszcze do końca poznany.
Prawdopodobnie jest wynikiem:
- chemicznego wiązania ze składnikami komórki,
- elektroadsorpcji barwnych anionów i kationów,
- rozpuszczania się barwnika w określonych składnikach chemicznych komórki.
2. Wykonanie preparatów utrwalonych
Preparaty utrwalone możemy podzielić na:
• Trwałe – mogą być używane wielokrotnie przez długi czas,
• Półtrwałe – jednorazowego użytku.
2.1. Preparaty półtrwałe
Preparaty półtrwałe uzyskuje się po utrwaleniu i wybarwieniu drobnoustrojów na
szkiełku podstawowym (rys. 3.). Nie zatapia się ich w balsamie.
Wykonanie rozmazu
Technika zależy od konsystencji badanego materiału. Jeśli mamy do czynienia z
pożywką płynną, to sporządzenie rozmazu polega na rozprowadzeniu kropli cienką warstwą
na środku odtłuszczonego szkiełka podstawowego. Rozmaz wykonuje się ezą, suszy na
powietrzu. Jeśli materiał pochodzi z hodowli stałej należy najpierw na szkiełku umieścić
kroplę wody i następnie – pobrany ezą materiał – rozprowadzić w tej kropli.
Z mięsa i produktów mięsnych, ryb, żółtego sera wykonuje się preparaty bezpośrednio
z badanych próbek. W tym celu wycięty jałowym skalpelem kawałek (np. mięsa, sera
twardego, wędliny) przenieść jałową pincetą na szkiełko podstawowe i odcisnąć na nim
wyraźny ślad, cienki i bez wolnych przestrzeni. Po wykonaniu rozmazu preparaty zostawiamy
do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
3
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
–
studia zaoczne
Ćwiczenie 1
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Rys. 3. Schemat wykonania preparatu półtrwałego
Utrwalanie preparatów
Utrwalenie przerywa zachodzące w komórkach procesy fizjologiczne i pozwala
zachować strukturę komórek, zapobiegając zmianom pośmiertnym. Ma na celu:
zabicie komórek drobnoustrojów;
przyklejenie się komórek do powierzchni szkiełka – nie spłukuje ich barwnik ani
woda;
odsłonięcie w ścianach komórkowych martwych mikroorganizmów związków, z
którymi łączy się barwnik.
Utrwalanie możemy wykonywać metodą:
termiczną
– wyschnięty preparat przeprowadzamy 3-krotnie w pozycji poziomej
(rozmazem do góry) przez płomień palnika
chemiczną
– do badania struktur komórkowych
,
przy użyciu 60–70% alkoholu, 10%
formaliny, sublimatu lub mieszaniny eteru i alkoholu (1:1). W tym celu na wysuszony
rozmaz nalewa się odpowiedni odczynnik. Po 5 – 10 min. zlewa się utrwalacz, suszy
na powietrzu i barwi jedną z podanych metod. Używając sublimatu lub formaliny
należy preparat dobrze przemyć wodą i wysuszyć.
Preparaty utrwalone barwi się, co pozwala na określenie kształtu drobnoustrojów, a także
obserwację układów komórek i struktur komórkowych.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
4
M
IKROBIOLOGIA
T
ECHNICZNA
–
studia zaoczne
Ćwiczenie 1
część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Barwienia preparatów utrwalonych
W mikrobiologii mają zastosowanie następujące sposoby barwienia:
barwienie proste
– gdzie używamy jednego roztworu barwnika, barwnik zlewa się,
spłukuje wodą, alkoholem lub acetonem i osusza bibułą; stosowane w celu ustalenia
kształtu i układu komórek, np. barwienie fioletem krystalicznym lub błękitem
metylenowym
barwienie złożone
– z użyciem co najmniej 2 roztworów barwników, barwienie albo
w ściśle określonej kolejności albo ich mieszaniną; np. barwienie metodą Grama
W zależności od stosowanych barwników, można wyróżnić 3 sposoby barwienia:
barwienie pozytywowe
– polegające na zabarwieniu komórek, podczas gdy tło
zostaje bezbarwne; może być proste lub złożone,
barwienie negatywowe
– uzyskanie kontrastu między ciemnym tłem a nie
zabarwionymi komórkami; stosowane jest zwykle do barwienia krętków i otoczek
bakterii; wykorzystuje się roztwór nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny,
rozmaz wykonuje się z zawiesiny komórek zmieszanych z barwnikiem, nie utrwala
się, tylko od razu po wysuszeniu ogląda pod mikroskopem, może być proste lub
złożone,
barwienie pozytywowo-negatywowe
– połączenie powyższych metod, najpierw
wykonuje się barwienie negatywowe, a po wyschnięciu dobarwia się barwnikiem
pozytywowym.
2.2. Preparaty trwałe
Przygotowanie preparatów trwałych obejmuje kilka etapów, z których najistotniejsze to:
utrwalenie, barwienie i zatopienie preparatu.
Utrwalenie materiału na szkiełku podstawowym można dokonać za pomocą
czynników fizycznych (ogrzewanie szkiełka z rozmazem zawiesiny drobnoustrojów w
płomieniu palnika) lub chemicznych (etanol, metanol, formalina, kwas pikrynowy,
dwuchromian potasu). Po wyschnięciu preparat barwi się, a następnie pokrywa balsamem
kanadyjskim. Po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym, lekko ogrzewa do rozpuszczenia
balsamu, dociska szkiełko i usuwa nadmiar balsamu. Tak przygotowany preparat może być
przechowywany przez długi czas.
__________________________________________________________________________________________
K
ATEDRA
T
ECHNOLOGII
F
ERMENTACJI I
M
IKROBIOLOGII
T
ECHNICZNEJ
5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]