utf-8''hodowla periodyczna d robnoustrojów 2007-2008 1, Biotechnologia, Podstawy biotechnologii [ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA PERIODYCZNADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIl. Wstęp teoretyczny.Wzrost drobnoustrojów to przyrost ich objętości, masy, a także podział komórek. Jest onuwarunkowany syntezą materiału komórkowego (białka, kwasy nukleinowe, nukleotydy),tworzeniem nowych organelli komórkowych a także dobudowywaniem nowych struktur do jużistniejących (ściana komórkowa, błona cytoplazmatyczna). Tempo wzrostu drobnoustrojów jestuzależnione od składu podłoża hodowlanego oraz od odczynników fizykochemicznych, takichjak temperatura, pH, potencjał redox. Maksymalny wzrost można osiągnąć tylko wówczas, gdyskładniki podłoża znajdują się w wystarczających ilościach, gdy nie zachodzi limitowaniewzrostu przez któryś ze składników oraz gdy zapewnione są optymalne warunki pH, temperaturyitp. Mówimy wtedy o warunkach wzrostu ,,nieorganicznego”. W hodowli periodycznej(okresowej) warunki takie mają miejsce tylko w początkowym okresie wzrostu. W następnychokresach następuje zmniejszenie stężenia składników odżywczych oraz nagromadzenieproduktów metabolizmu tj. kwasów organicznych czy alkoholi, co wpływa na wzrostdrobnoustrojów.W warunkach hodowli okresowej, gdzie tylko w początkowym okresie ma miejsce wzrostnieograniczony, wyróżnić możemy charakterystyczne fazy wzrostu: fazę przygotowawczą (lag-faza), fazę logarytmicznego wzrostu (log-faza), fazę stacjonarną (równowagi) i fazę zamieraniahodowli.W warunkach wzrostu nieograniczonego, a więc w pierwszej fazie hodowli okresowej,drobnoustroje dzielą się z jednakową szybkością. Liczba ich wzrasta z postępemgeometrycznym: 2, 21, 22, 23.. 2n. Jeśli w jednostce objętości hodowli na początku znajdowałosię Nkomórek, to ponpodziałach będzie ich:N = N×2ngdzie:N= ilość początkowa komórek (CFU) w godzinie t = 0 (t)N = ilość komórek (CFU) po czasie t1, hLogarytmując to równanie otrzymamy:Log N = log N+nlog 2Wyliczając z tego równania liczbę podziałówn,otrzymujemy:1PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA PERIODYCZNADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIn =log N – log Nlog 2Wprowadzając pojęcie częstości podziałówv,czyli liczbę podziałów komórek w ciągu czasut,możemy zapisać,że:v=gdzie:t- czas w godzinie t = 0, ht1– czas kolejnego pomiaru, hCzas niezbędny dla podziału komórki nazywamy wiekiem osobniczymg.g=t=n1vntlog N – log Nlog 2 (t – t)2. Sprzęt, odczynniki i pożywki:Pożywka Kojim’a:Na2HPO4x 12H2KH2PO4NH4C1MgSO4x 7H2Ekstrakt drożdżowy4,0 g/l0,5 g/l0,5 g/l0,l g/l0,5 g/lustalić pH w granicach 7,3 – 7,4woda destylowanafenol 0,5 MR-34-24/25; S:53-28-45Zestaw odczynników do oznaczania fenolup-nitroanilinaR-33-52/53-23/24/25; S:53-28-45-61-36/37NaNO2Na2CO3NaOH2%10%10%5 mM2PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA PERIODYCZNADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIRoztwór mikroelementów TMS (0,1 ml TMS/100 ml pożywki) o składzie: FeSO4x 7H2O 3,82 g;CoSO4x 7H2O 295 mg; MnSO4x H2O 82 mg; ZnSO4x 7H2O 141mg; H3BO36 mg; Na2MoO4x2H2O 40 mg; NiSO4x 7H2O 82 mg; CuSO4x 5H2O 2,9 mg; Al2(SO4)3x 18H2O 148 mg;Na2WO4x 2H2O 6 mg rozpuszczonych w 10 ml 32% HCl i uzupełnionych wodą destylowaną doobjętości 1000 ml.Kolby hodowlane o objętości 500 ml (7 sztuk), probówki z solą fizjologiczną, probówki miarowedo oznaczania fenolu, probówki typu Eppendorf, tipsy o objętości 200µli 1000µl,płytki zagarem odżywczym (30 sztuk), szklana głaszczka, kuwety plastikowe, Spekol, wirówka3. Wykonanie.Celemćwiczeniajest sprawdzeniewpływu stężenia fenoluna szybkość rozkładu tego substratuprzez szczepAcinetobactersp. W tym celu należy założyć 5 układów hodowlanych o objętości250 ml, w dwóch powtórzeniach, zgodnie z Tabelą I:UWAGA! Objętości podane w dwóch ostatnich kolumnach mogą się różnić, w zależności od gęstości wyjściowejhodowliTabela IObjętość 0,4 MOznaczenie StężenieObjętośćr-rukolbyfenolu,wzorcowego TMS, mlmMfenolu, mlKolba A1Kolba A1Kolba B1Kolba B2Kolba C1Kolba C2Kolba D1Kolba D2Kolba E1Kolba E211223344550,6250,6251,251,251,8751,8752,52,53,1253,1250,250,250,250,250,250,250,250,250,250,25ObjętośćpożywkiKojim’a, ml200200200200200200200200200200Objętość pożywkiObjętość hodowli Kojim’a użyta douzupełnieniaszczepuAcinetobactersp., objętości hodowlido 250 ml,mlml409,254040404040404040409,258,758,758,258,257,757,757,257,253PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA PERIODYCZNADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIW każdej kolbie określić gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przyλ= 600 nm orazwyjściowe stężenie fenolu poprzez pomiar metodą zp-nitroaniliną.Wyniki umieścić w Tabeli II.Kolby inkubować w temperaturze 30°C w warunkach wytrząsania (130 rpm).UWAGA! Zachować sterylne warunki w trakcie pracy!!!W odstępach jednogodzinnych określać gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przyλ= 600 nm i metodą płytkową w kolbie oznaczonej D1 oraz sprawdzać ubytek fenolu poprzezoznaczanie stężenia fenolu metodą zp-nitroaniliną.Wyniki umieszczać w Tabeli II. Napodstawie otrzymanych wyników narysować wykresy ubytku fenolu oraz przyrostu liczbykomórek w funkcji czasu w hodowlach szczepuAcinetobactersp.dla każdego z 5 układówhodowlanych.4. Obliczenia i opracowanie wyników:Oznaczanie fenolu metodą kolorymetryczną zp-nitroaniliną1. Pobrać sterylnie 1 ml hodowli i umieścić w probówce typu Eppendorf. Zawartość probówkiwirować przez 5 min przy 12000 rpm w temperaturze 4°C.2. Do szklanej probówki miarowej wprowadzić 1 ml odwirowanej hodowli (supernatant) albojej odpowiednie rozcieńczenie, tj. na przykład rozcieńczenie 10-krotne uzyskuje się poprzezpobranie 100µlsupernatantu i 900µlwody destylowanej.3. Dodać 4 ml wody destylowanej.4. Wprowadzić 1 ml zdwuazowanejp-nitroaniliny(otrzymanej poprzez odbarwienieżółtegoroztworup-nitroanilinyz użyciem 2% NaNO2)5. Dodać 0,5 ml 2% Na2CO3.6. Wprowadzić 1 ml 10% NaOH w celu utrwalenia barwy.7. Uzupełnić probówkę do objętości 10 ml poprzez wprowadzenie 2,5 ml wody destylowanej.8.Jednocześnie przygotować próbęślepąw identyczny sposób (od punktu 2), zastępującsupernatant wodą destylowaną.9. Po wymieszaniu zmierzyć absorbancję przyλ= 550 nm względem próbyślepej.10. Uzyskane wyniki absorbancji umieścić w Tabeli II i III.4PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA PERIODYCZNADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGII11. Do przeliczeń stężeń fenolu stosować równanie krzywej kalibracyjnej A = b * cfenolu, gdzie Ato absorbancja przyλ= 550 nm, cfenoluto stężenie fenolu wyrażone w mM, b = współczynnikkrzywej kalibracyjnej obliczony metodą najmniejszych kwadratów (patrz: Aneks Tabela IV).Wyniki umieścić w Tabeli II.Wyznaczanie wzrostu bakterii poprzez pomiar absorbancji przyλ= 600 nmW tym celu należy pobrać po 1 ml z każdego układu hodowlanego i zmierzyć absorbancjęprzy długości faliλ= 600 nm z użyciem spektrofotometru HELIOS wobec próbyślepej,którastanowi pożywka mineralna Kojim’a nie zaszczepiona komórkami bakterii. Pomiaru dokonywaćw odstępach godzinnych, a uzyskane wyniki zebrać w Tabeli II.Wyznaczanie wzrostu bakterii metodą płytkowąZ jednego układu hodowlanego oznaczonego jako kolbaD1pobrać sterylnie 1 mlzawiesiny bakteryjnej i wprowadzić do probówki z 9 ml soli fizjologicznej i dokładniewymieszać (rozcieńczenie 10-1). Przygotować szereg rozcieńczeń w soli fizjologicznej zgodnie zTabelą V. Z odpowiednich rozcieńczeń (Tabela V) wysiać po 50μlzawiesiny bakterii na płytki zagarem odżywczym i inkubować 24- 48 godzin w temperaturze 30ºC. Po tym czasie policzyćwyrosłe kolonie przyjmując,żejedna kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej (CFU –ang.Colony Forming Unit).Ilość bakterii w 1 ml badanego materiału obliczyć ze wzoru:X=a×b×20gdzie:a – ilość koloniib – rozcieńczenieX – ilość bakterii w 1 ml zawiesinyWyniki przeliczyć w skali logarytmicznej i umieścić w Tabeli V. W oparciu o uzyskanewyniki wyliczyć częstość pokoleń (�½) oraz wiek osobniczy (g).5PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/ [ Pobierz całość w formacie PDF ]