utf-8''hodowla ciągła drobnoustrojów 1, Biotechnologia, Podstawy biotechnologii [ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA CIĄGŁADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIl. Wstęp teoretyczny.W ciągłych hodowlach drobnoustrojów po wstępnym namnożeniu mikroorganizmówrozpoczyna się stałe zasilanie hodowliświeżąpożywką z jednoczesnym odbiorem płynuhodowlanego, przy zachowaniu stałej objętości cieczy w fermentorze.Ze względu na sposób kontroli i kierowania procesem hodowli ciągłej wyróżniamy dwie głównemetody jej prowadzenia oparte na:a) zasadzie turbidostatu- ze stałym stężeniem biomasyb) zasadzie chemostatu- ze stałą szybkością rozcieńczania.Na rysunku l przedstawiono schemat układu do hodowli ciągłej drobnoustrojów. W reaktorzetego typu zakłada się idealny stan wymieszania, w wyniku czego skład płynu hodowlanego itemperatura są w każdym punkcie reaktora identyczne. Na rysunku 2 przedstawiono graficznąinterpretację zależności pomiędzy parametrami pracy fermentora, a więc produktywnością (Dx),szybkością rozcieńczania (D), stężeniem biomasy (x) i stężeniem substratu (S). Produktywnośćjest to masa drobnoustrojów przypadająca na jednostkę objętości i jednostkę czasu [kg/(l* h)].Stężenie biomasy i substratu jest praktycznie niezmienne w szerokich granicach wartościszybkości rozcieńczania. Zbliżając się do wartości Dmaxukład staje się niestabilny i nawetniewielkie zmiany wartości szybkości rozcieńczania mogą powodować znaczne zmiany stężeniabiomasy i substratu. Produktywność biomasy osiąga swoje maksimum w zakresie wysokichwartości D, w granicach których układ nie wykazuje dostatecznej stabilności.Podstawową różnicą hodowli ciągłej w porównaniu z hodowlą okresową jest brak fazowościwzrostu. Hodowle ciągłe wykazują wiele zalet w porównaniu z procesami okresowymi:a) wyeliminowanie zmian warunków hodowli w czasie jej trwaniab) możliwość prowadzenia hodowli w dowolnie długim czasiec) możliwość regulacji stanu fizjologicznego drobnoustrojówd) jednorodność składu fizycznego i chemicznego hodowlie) możliwość automatyzacjiMimo tych korzyści procesy ciągłe nie są powszechnie wykorzystywane w praktyceprzemysłowej. Związane jest to z następującymi trudnościami:1PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA CIĄGŁADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIa) możliwością degeneracji szczepów lub opanowania hodowli przez mutanty o gorszychwłasnościach technologicznychb) problemami z utrzymaniem aseptycznych warunkówc) niesprzyjającymi warunkami produkcji niektórych substancji wytwarzanych przez komórkinie rosnąced) tworzeniem przez drobnoustroje wielokomórkowych agregatów, kłaczków oraz zarastaniemścianfermentora i przewodów.dopływ powietrzapompaodpływ powietrzapompadopływodpływRys. 1. Ogólny schemat bioreaktora (chemostat)Rys. 2. Stężenie substratu (S), biomasa (x) i produktywność (Dx) jako funkcje szybkości rozcieńczenia2PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA CIĄGŁADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGII2. Sprzęt, odczynniki i pożywki.biofermentor z oprzyrządowaniem, spekol, kuwety plastykowe, autoklaw, probówki do oznaczeńturbidymetrycznych, probówki miarowe do oznaczeń fenolu, zestaw do sączenia próżniowego,sączki Co-5, pipety, tryskawka z wodą destylowaną, cylinder miarowy 50 ml, zlewki, wirówka20 h hodowlaAcinetobactersp. (inokulum),750 ml + 500 ml + 250 ml pożywki o składzie:Na2HP04*12H2KH2P04NH4C1MgS04*7H2Ekstrakt drożdżowy4,0 g/l0,5 g/l0,5 g/l0,l g/l0,5 g/lustalić pH w granicach 7,3 – 7,4woda destylowanafenol 0,5 M R-34-24/25; S:53-28-45Zestaw odczynników do oznaczania fenolup-nitroanilinaR-33-52/53-23/24/25S:53-28-45-61-36/375 mM2%10%10%NaNO2Na2CO3NaOH3. Wykonanie.Zmontować bioreaktor wraz z termometrem, wlać 750 ml pożywki i sterylizować wautoklawie w temp. 121°C przez 15 minut. Po sterylizacji i ostygnięciu bioreaktora zamontowaćbioreaktor w statywie fermentora. Podłączyć mieszadło, termometr, pH-metr płaszcz grzejny,pompę dozującą pożywkę oraz kompresor dostarczający powietrza do napowietrzaniawgłębnego. Przygotować odbiór płynu hodowlanego do wyjałowionej kolby poprzez układodprowadzający. Za pomocą termostatu ustalić temperaturę w bioreaktorze na poziomie 30°C.Rozpocząć hodowlę poprzez zaszczepienie położą 250 ml 20 h hodowliE. colina tym samym3PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA CIĄGŁADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIpodłożu, wlewając inokulum przez płomień palnika oraz dodając fenol tak, aby w fermentorzestężenie jego wynosiło 4 mM.Parametry procesu hodowlanego: przepływ powietrza początkowy 1,0 l/min zwiększaćstopniowo do 1,5 l/min, obroty mieszadła ustalić na 250 obr/ min.Po zaszczepieniu pożywki pobrać 30 ml podłoża do oznaczenia zmętnienia metodąturbidymetryczną. Oznaczenie to powtarzać co l godzinę w trakcie prowadzenia procesu,sporządzając wykres zmętnienia w funkcji czasu. Po rozpoczęciu fazy logarytmicznego wzrostu(wyznaczyć na podstawie przyrostu zmętnienia) pobrać 20 ml podłoża do oznaczenia suchejmasy metodą filtracji na sączkach membranowych. Po godzinie od poprzedniego oznaczeniaponownie oznaczyć stężenie biomasy. Na postawie przyrostu biomasy obliczyć maksymalnąwłaściwą szybkość wzrostuµmaxszybkość rozcieńczaniaD(przyjąć wartośćDna poziomie 50%µmax) oraz natężenie przepływu pożywkiF.Po osiągnięciu wczesnej fazy stacjonarnej rozpocząćdawkowanie pożywki z obliczonym uprzednio natężeniem przepływuF.Oznaczyć stężeniefenolu w odpływie i w pożywce oraz suchą masę w odpływie. Na tej podstawie obliczyćkońcową wydajność uzyskanej biomasy bakterii.4. Obliczenia i opracowanie wyników.Wzrost nieograniczony drobnoustrojów przebiega zgodnie z kinetyką procesów auto-katalitycznych (reakcja I rzędu), w których szybkość jest wprost proporcjonalna do stężeniaautokatalizatora. W hodowli autokatalizatorem są komórki drobnoustrojów (ołącznejmasie x1),można więc napisać:∆x/∆t=µ* X1, stąd po przekształceniuµ= (l/X1) *∆x/∆t, a także:∆x/∆t=(X2-X1) / (t2- t1)gdzie:∆x/∆t- szybkość wzrostu, kg /hµ- właściwa szybkość wzrostu, 1 /hx1–ilość biomasy w bioreaktorze w czasie t1, kgx2–ilość biomasy w bioreaktorze w czasie t2, kgt1- czas pierwszego pomiaru biomasy, ht2- czas drugiego pomiaru biomasy, h4PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/KATEDRA BIOCHEMIIWydział Biologii i OchronyŚrodowiskaHODOWLA CIĄGŁADROBNOUSTROJÓWPODSTAWYBIOTECHNOLOGIIW chemostacie wielkością stałą jest szybkość rozcieńczania D, czyli stosunek wartościobjętościowego natężenia przepływu pożywki do objętości pożywki w fermentorze.D = F / V,stąd po przekształceniuF = D * Vgdzie:F - objętościowe natężenie przepływu pożywki, dm3/hV - objętość pożywki w fermentorze, dm3D - szybkość rozcieńczania, l/hPonieważ założono D na poziomie 50% więc:F=0,5 *µmax* VWartość natężenia przepływu pożywki wyliczoną z powyższego wzoru należy ustawić napompie dozującej pożywkę do fermentora. W trakcie procesu ciągłego w fermentorze wartościąstałą jest także współczynnik wydajności biomasy Y, który wiąże szybkość wzrostu z szybkościązużycia substratu. Opisuje on więc, jaką biomasę można otrzymać po dostarczeniu do fermentorajednostkowej masy substratu. W praktyce współczynnik ten jest mniejszy od l, ponieważ substratzużywany jest nie tylko do produkcji biomasy, ale także spalany w celu dostarczenia energii.Oblicza się go ze wzoru;Y = -∆x/∆S= - (x2– x1) / (S2– S1)gdzie:Y - wydajność biomasy∆x-ilość biomasy powstałej w procesie, kg∆S- ilość substratu zużytego w procesie, kgx1- ilość biomasy w pożywce, kgx2- ilość biomasy w odpływie, kgS1- ilość substratu w pożywce, kgS2- ilość substratu w odpływie, kg5PDF stworzony przez wersję demonstracyjną pdfFactorywww.pdffactory.pl/ [ Pobierz całość w formacie PDF ]